熒光法硫胺素（維生素B1）的測定方法

1．原理
硫胺素在堿性鐵氰化鉀溶液中被氧化成噻嘧色素，在紫外線下，噻嘧色素發出熒光。在給定的條件下，以及沒有其他熒光物質干擾時，此熒光之強度與噻嘧色素量成正比，即與溶液中硫胺素量成正比。
如樣品中含雜質過多，應經過離子交換劑處理，使硫胺素與雜質分離，然后以所得溶液作測定。
本方法的最小檢出限為0.05μg。
2．適用范圍
GB12390-90 本方法適用于各類食物中硫胺素的測定，但不適用于有吸附硫胺素能力的物質和含有影響噻嘧色素熒光物質的樣品。
3．儀器
3.1電熱恒溫培養箱
3.2熒光分光光度計
4． 試劑
本實驗用水均為蒸餾水，試劑不加說明均為分析純試劑
4.1 正丁醇：分析純需經重蒸餾后使用。
4.2 無水硫酸鈉：Na2SO4。
4.3 淀粉酶和蛋白酶：國產或進口均可。
4.4 0.1mol/L鹽酸：8.5ml濃鹽酸（比重1.19或1.20）用水稀釋至1000ml。
4.5 0.3mol/L鹽酸：25.5ml濃鹽酸用水稀釋至1000ml。
4.6 2mol/L乙酸鈉溶液：164g無水乙酸鈉溶于水中稀釋至1000ml。
4.7 25%氯化鉀溶液：250g氯化鉀溶于水中稀釋至1000ml。
4.8 25%酸性氯化鉀溶液：8.5ml濃鹽酸用25%氯化鉀溶液稀釋至1000ml。
4.9 15%氫氧化鈉溶液：15g氫氧化鈉溶于水中稀釋至100ml。
4.10 1%鐵氰化鉀溶液：1g鐵氰化鉀溶于水中稀釋至100ml，放于棕色瓶內保存。
4.11 堿性鐵氰化鉀溶液：取4ml1%鐵氰化鉀溶液，用15%氫氧化鈉溶液稀釋至60ml。用時現配，避光使用。
4.12 3%乙酸溶液：30ml冰乙酸用水稀釋至1000ml。
4.13 活性人造浮石：稱取200g40~60目的人造浮石，以10倍于其容積的3%熱乙酸溶液攪洗2次，每次10min；再用5倍于其容積的25%熱氯化鉀溶液攪洗15min；然后再用3%熱乙酸溶液攪洗10min；最后用熱蒸餾水洗至沒有氯離子。于蒸餾水中保存。
4.14 0.04%溴甲酚綠溶液：稱取0.1g溴甲酚綠，置于小研缽中，加入1.4mL0.1mol/L氫氧化鈉研磨片刻，再加入少許水繼續研磨至完全溶解，用水稀釋至250mL。
4.15 標準
4.15.1 硫胺素標準貯備液（0.1mg/ml）：準確稱取100mg經氯化鈣干燥24h的硫胺素，溶于0.01mol/L鹽酸中，并稀釋至1000ml。于冰箱中避光保存。
4.15.2 硫胺素標準中間液（10μg/ml）：將硫胺素標準貯備液用0.01mol/L鹽酸稀釋10倍，于冰箱中避光保存。
4.15.3 硫胺素標準工作液（0.1μg/ml）：將硫胺素標準中間液用水稀釋100倍，用時現配。
5.操作步驟
5.1 樣品制備
樣品采集后用勻漿機打成勻漿于低溫冰箱中冷凍保存，用時將其解凍后混勻使用。干燥樣品要將其盡量粉碎后備用。
5.2 提取
5.2.1精確稱取一定量試樣（估計其硫胺素含量約為10~30μg，一般稱取2~10g試樣），置于100ml三角瓶中，加入50ml 0.1mol/L或0.3mol/L鹽酸使其溶解，放入高壓鍋中加熱水解121℃30min，涼后取出。
5.2.2 用2mol/L乙酸鈉調其pH值為4.5（以0.04%溴甲酚綠為外指示劑）。
5.2.3 按每克樣品加入20mg淀粉酶和40mg蛋白酶的比例加入淀粉酶和蛋白酶。于45~50℃溫箱過夜保溫（約16h）。
5.2.4 涼至室溫，定容至100ml，然后混勻過濾，即為提取液。
5.3 凈化
5.3.1用少許脫脂棉鋪于鹽基交換管的交換柱底部，加水將棉纖維中氣泡排出，再加約1g活性人造浮石使之達到交換柱的三分之一高度。保持鹽基交換管中液面始終高于活性人造浮石。
5.3.2 用移液管加入提取液20~60ml（使通過活性人造浮石的硫胺素總量約為2~5μg）。
5.3.3 加入約10ml熱蒸餾水沖洗交換柱，棄去洗液。如此重復三次。
5.3.4 加入25%酸性氯化鉀（溫度為90℃左右）20ml，收集此液于25ml刻度試管內，涼至室溫，用25%酸性氯化鉀定容至25ml，即為樣品凈化液。
5.3.5 重復上述操作，將20ml硫胺素標準使用液加入鹽基交換管以代替樣品提取液，即得到標準凈化液。
5.4 氧化
5.4.1 將5ml樣品凈化液分別加入A、B兩個反應瓶。
5.4.2 在避光條件下將3ml 15%氫氧化鈉加入反應瓶A，將3ml堿性鐵氰化鉀溶液加入反應瓶B，振搖約15s，然后加入10ml正丁醇；將A、B兩個反應瓶同時用力振搖1.5min。
5.4.3 重復上述操作，用標準凈化液代替樣品凈化液。
5.4.4 靜置分層后吸去下層堿性溶液，加入2~3g無水硫酸鈉使溶液脫水。
5.5 測定
5.5.1熒光測定條件：
激發波長365nm；發射波長435nm；激發波狹縫5nm；發射波狹縫5nm。
5.5.2依次測定下列熒光強度：
a. 樣品空白熒光強度（樣品反應瓶A）；
b. 標準空白熒光強度（標準反應瓶A）；
c. 樣品熒光強度（樣品反應瓶B）；
d. 標準熒光強度（標準反應瓶B）；
6.計算
              c·V V1 1 100
X=（U－Ub）×────×──×──×───
              （S－Sb） V2 m 1000
式中：X──樣品中硫胺素含量，mg/100g；
U──樣品熒光強度；
Ub──樣品空白熒光強度；
S──標準熒光強度；
Sb──標準空白熒光強度；
c──硫胺素標準工作液濃度，μg/ml；
V──用于凈化的硫胺素標準工作液體積，ml；
V1──樣品水解后定容之體積，ml；
V2──樣品用于凈化的提取液體積，ml；
m──樣品質量，g；
100
── ──樣品含量由μg/g換算成mg/100g的系數。
1000
例：麩皮2.019g，共有提取液100ml，取20ml經鹽基交換管過濾，得提純液25ml。取5ml提純液做測定，得出如下結果：
U=52.81 S=45.83 Ub=3.795 Sb=2.692
                0.1×20 100 1 100
（52.81－3.795）×------×--×--×--- = 0.56 mg/100g
               （45.83－2.692） 20 2.019 1000

7.注意事項
7.1加熱酸性氯化鉀而不使其沸的原因是熱氯化鉀濾速較快，而不沸則是使其不至因過飽和而在洗滌中結晶析出阻塞交換柱。被洗下的硫胺素在酸性氯化鉀中極其穩定，可保存一周以上。
7.2硫胺素在堿性環境中被鐵氰化鉀氧化成噻嘧色素，振搖15s是使其充分反應，這期間應保證黃色不退證明鐵氰化鉀量充足不被其它還原性雜質耗盡，而強堿又可破壞硫胺素，所以除加入堿性鐵氰化鉀時邊搖勻邊加入外，其加入量一定不能過多，否則硫胺素被破壞。
7.3步驟5.4.2是整個實驗的關鍵，對每個樣品所加試劑的次序、快慢、振搖時間等都必須盡量一致，尤其是用正丁醇提取噻嘧色素時必須保證準確振搖90s。