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  • 抗壞血酸(維生素C)的測定方法

    發布于 2011/12/21閱讀(1798)來源 zxj標簽 維生素

    摘要

    在測定維生素C的國標方法中,熒光法為測定食物中維生素C含量的第一標準方法,2、4-二硝基苯肼法作為第二法。

    內容

    抗壞血酸(維生素C)的測定方法
    在測定維生素C的國標方法中,熒光法為測定食物中維生素C含量的第一標準方法,2、4-二硝基苯肼法作為第二法。

    一、熒光法
    1.原理
    樣品中還原型抗壞血酸經活性炭氧化成脫氫型抗壞血酸后,與鄰苯二胺(OPDA)反應生成具有熒光的喹喔啉(quinoxaline),其熒光強度與脫氫抗壞血酸的濃度在一定條件下成正比,以此測定食物中抗壞血酸和脫氫抗壞血酸的總量。
    脫氫抗壞血酸與硼酸可形成復合物而不與OPDA反應,以此排除樣品中熒光雜質所產生的干擾。本方法的最小檢出限為0.022g/ml。
    2.適用范圍
    GB12392-90 本方法適用于蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定
    3.儀器
    3.1.實驗室常用設備。
    3.2.熒光分光光度計或具有350nm及430nm波長的熒光計。
    3.3.打碎機。
    4.試劑
    本實驗用水均為蒸餾水,試劑不加說明均為分析純試劑。
    (1)偏磷酸-乙酸液:稱取15g偏磷酸,加入40ml冰乙酸及250ml水,攪拌,放置過夜使之逐漸溶解,加水至500ml。4℃冰箱可保存7~10天。
    (2)0.15 mol/L硫酸:取10ml硫酸,小心加入水中,再加水稀釋至1200ml。
    (3)偏磷酸-乙酸-硫酸液:以0.15mol/L硫酸液為稀釋液,其余同4.1.配制。
    (4)50% 乙酸鈉溶液:稱取500g乙酸鈉(CH3COONa·3H2O),加水至1000ml。
    (5)硼酸-乙酸鈉溶液:稱取3g硼酸,溶于100ml乙酸鈉溶液(4.4)中。臨用前配制。
    (6) 鄰苯二胺溶液:稱取20mg鄰苯二胺,于臨用前用水稀釋至100ml。
    (7)0.04%百里酚藍指示劑溶液:稱取0.1g百里酚藍,加0.02mol/L氫氧化鈉溶液,在玻璃研缽中研磨至溶解,氫氧化鈉的用量約為10.75ml,磨溶后用水稀釋至250ml。
    變色范圍:pH=1.2 紅色
    pH=2.8 黃色
    pH>4.0 蘭色
    (8)活性炭的活化:加200g炭粉于1L1+9鹽酸中,加熱回流1~2h,過濾,用水洗至濾液中無鐵離子為止,置于110~120℃烘箱中干燥,備用。

    (9)標準
    抗壞血酸標準溶液(1mg/ml):準確稱取50mg抗壞血酸,用溶液(4.1)溶于50ml容量瓶中,并稀釋至刻度。
    抗壞血酸標準使用液(100μg/ml):取10ml抗壞血酸標準液,用偏磷酸-乙酸溶液稀釋至100ml。定容前試pH值,如其pH>2.2時,則應用溶液(4.3)稀釋。
    標準曲線的制備:取下述"標準"溶液(抗壞血酸含量10μg/ml)0.5、1.0、1.5和2.0ml標準系列,取雙份分別置于10ml帶蓋試管中,再用水補充至2.0ml。
    5.操作步驟
    5.1 樣品制備
    全部實驗過程應避光。
    稱取100g鮮樣,加100g偏磷酸-乙酸溶液,倒入打碎機內打成勻漿,用百里酚藍指示劑調試勻漿酸堿度。如呈紅色,即可用偏磷酸-乙酸溶液稀釋,若呈黃色或蘭色,則用偏磷酸-乙酸-硫酸溶液稀釋,使其pH為1.2。勻漿的取量需根據樣品中抗壞血酸的含量而定。當樣品液含量在40~100μg/ml之間,一般取20g勻漿,用偏磷酸-乙酸溶液稀釋至100ml,過濾,濾液備用。

    5.2氧化處理:分別取樣品濾液及標準使用液各100ml于帶蓋三角瓶中,加2g活性炭,用力振搖1min,過濾,棄去最初數毫升濾液,分別收集其余全部濾液,即樣品氧化液和標準氧化液,待測定。
    5.3 各取5ml標準氧化液于2個50ml容量瓶中,分別標明"標準"及"標準空白"。
    5.4 各取5ml樣品氧化液于2個50ml容量瓶中,分別標明"樣品"及"樣品空白"。
    5.5于"標準空白"及"樣品空白"溶液中各加5ml硼酸-乙酸鈉溶液,混合搖動15min,用水稀釋至50ml,在4℃冰箱中放置2h,取出備用。
    5.6 于"樣品"及"標準"溶液中各加入5ml50%乙酸鈉溶液,用水稀釋至50ml,備用。
    5.7 熒光反應
    取"標準空白"溶液,"樣品空白"溶液及(5.6)中"樣品"溶液各2ml,分別置于10ml帶蓋試管中。在暗室中迅速向各管中加入5ml鄰苯二胺,振搖混合,在室溫下反應35min,用激發光波長338nm、發射光波長420nm測定熒光強度。標準系列熒光強度分別減去標準空白熒光強度為縱坐標,對應的抗壞血酸含量為橫坐標,繪制標準曲線或進行相關計算,其直線回歸方程供計算時使用。
    6. 計算
    X=(c×V/m)×F×(100/1000)
    式中:X-----樣品中抗壞血酸及脫氫抗壞血酸總含量,mg/100g;
    c------由標準曲線查得或由回歸方程算得樣品溶液濃度,μg/ml;
    m-----試樣質量,g;
    F------樣品溶液的稀釋倍數;
    V------熒光反應所用試樣體積,ml。
    例:測定每一制備溶液的熒光強度。用標準溶液每ml含2.5μg、5.0μg、7.5μg及10.0μg,各標準濃度管讀數減去相應的標準空白讀數的各平均值做標準曲線。
    由樣品液讀數減去樣品液空白讀數之值,從標準曲線上查得相應的抗壞血酸(μg/ml),按取樣量及稀釋率計算樣品中抗壞血酸的含量。
    如:取制備好的辣椒樣品2.138g,稀釋到100ml,氧化后分別取10ml濾液稀釋到50ml
    樣品讀數為23.34,樣品空白讀數為3.188,樣品讀數減去樣品空白讀數為20.152,查熒光標準曲線相當標準抗壞血酸的2.23μg。

    2.23×100 50 100
    -----×-×-- = 52(mg/100g)
    2.138 10 1000

    7.注意事項
    7.1大多數植物組織內含有一種能破壞抗壞血酸的氧化酶,因此,抗壞血酸的測定應采用新鮮樣品并盡快用偏磷酸-醋酸提取液將樣品制成勻漿以保存維生素C。
    7.2 某些果膠含量高的樣品不易過濾,可采用抽濾的方法,也可先離心,再取上清液過濾。
    7.3活性炭可將抗壞血酸氧化為脫氫抗壞血酸,但它也有吸附抗壞血酸的作用,故活性炭用量應適當與準確,所以,應用天平稱量。我們的實驗結果證明,用2g活性炭能使測定樣品中還原型抗壞血酸完全氧化為脫氫型,其吸附影響不明顯。


    二、2,4-二硝基苯肼法
    1.原理
    總抗壞血酸包括還原型、脫氫型和二酮古樂糖酸。樣品中還原型抗壞血酸經活性炭氧化為脫氫抗壞血酸,再與2,4-二硝基苯肼作用生成紅色脎,脎的含量與總抗壞血酸含量成正比,進行比色測定。
    2.適用范圍
    GB12392-90 本方法適用于蔬菜、水果及其制品中總抗壞血酸的測定。
    3. 儀器
    3.1恒溫箱:37±0.5℃
    3.2可見-紫外分光光度計
    3.3打碎機
    4.試劑
    本實驗用水均為蒸餾水,試劑純度均為分析純。
    4.1 4.5mol/L硫酸:謹慎地加250ml硫酸(比重1.84)于700ml水中,冷卻后用水稀釋至1000ml。
    4.2 85%硫酸:謹慎地加900ml硫酸(比重1.84)于100ml水中。
    4.32%2,4-二硝基苯肼溶液:溶解2g2,4-二硝基苯肼于100ml4.5mol/L硫酸內,過濾。不用時存于冰箱內,每次用前必須過濾。
    4.4 2%草酸溶液:溶解20g草酸于700ml水中,稀釋至1000ml。
    4.5 1%草酸溶液:稀釋500ml 2%草酸溶液到1000ml。
    4.6 1%硫脲溶液:溶解5g硫脲于500ml 1%草酸溶液中。
    4.7 2%硫脲溶液:溶解10g硫脲于500ml1%草酸溶液中。
    4.8 1mol/L鹽酸:取100ml鹽酸,加入水中,并稀釋至1200ml。
    4.9活性炭:將100g活性炭加到750ml1mol/L鹽酸中,回流1~2h,過濾,用水洗數次,至濾液中無鐵離子(Fe3+)為止,然后置于110℃烘箱中烘干。
    4.10 標準
    (1)抗壞血酸標準溶液(1mg/ml):溶解100mg純抗壞血酸于100ml 1%草酸溶液中。
    (2)標準曲線繪制
    加1g活性炭于50ml標準溶液中,搖動1min,過濾。
    取10ml濾液放入500ml容量瓶中,加5.0g硫脲,用1%草酸溶液稀釋至刻度??箟难釢舛葹?0μg/ml。
    取5,10,20,25,40,50,60ml稀釋液,分別放入7個100ml容量瓶中,用1%硫脲溶液稀釋至刻度,使最后稀釋液中抗壞血酸的濃度分別為1,2,4,5,8,10及12μg/ml。
    按樣品測定步驟形成脎并比色。
    以吸光值為縱坐標,以抗壞血酸濃度(μg/ml)為橫坐標繪制標準曲線。
    5. 操作步驟
    5.1樣品制備
    全部實驗過程應避光。
    5.1.1鮮樣制備:稱100g鮮樣和100g2%草酸溶液,倒入打碎機中打成勻漿,取10-40g勻漿(含1-2mg抗壞血酸)倒入100ml容量瓶中,用1%草酸溶液稀釋至刻度,混勻。
    5.1.2干樣制備:稱1-4g干樣(含1-2mg抗壞血酸)放入乳缽內,加入1%草酸溶液磨成勻漿,倒入100ml容量瓶中,用1%草酸溶液稀釋至刻度,混勻。
    5.1.3將上述兩液過濾,濾液備用。不易過濾的樣品可用離心機沉淀后,傾出上清液,過濾,備用。
    5.2氧化處理:取25ml上述濾液,加入0.5g活性炭,振搖1min,過濾,棄去最初數毫升濾液。取10ml此氧化提取液,加入10ml2%硫脲溶液,混勻。
    5.3呈色反應
    5.3.1于三個試管中各加入4ml稀釋液。一個試管作為空白,在其余試管中加入1.0ml2%2,4-二硝基苯肼溶液,將所有試管放入37±0.5℃恒溫箱或水浴中,保溫3h。
    5.3.23h后取出,除空白管外,將所有試管放入冰水中??瞻坠苋〕龊笫蛊淅涞绞覝?,然后加入1.0ml2%2,4-二硝基苯肼溶液,在室溫中放置10~15min后放入冰水內。其余步驟同樣品。
    5.3.385%硫酸處理:當試管放入冰水后,向每一試管中加入5ml85%硫酸,滴加時間至少需要1min,需邊加邊搖動試管。將試管自冰水中取出,在室溫放置30min后比色。
    5.3.4 比色:用1cm比色杯,以空白液調零點,于500nm波長測吸光值。
    6. 計算
    同熒光法。
    7. 注意事項
    7.1大多數植物組織內含有一種能破壞抗壞血酸的氧化酶,因此,抗壞血酸的測定應采用新鮮樣品并盡快用2%草酸溶液制成勻漿以保存維生素C。
    7.2 若溶液中含有糖,硫酸加得太快,溶解熱會使溶液變黑。
    7.3 試管自冰水中取出后,顏色會繼續變深,所以,加入硫酸后30分鐘應準時比色。

     

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